金黄色葡萄球菌

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本期为大家推送来自NatCommun的一篇文章——ReleaseofStaphylococcusaureusextracellularvesiclesandtheirapplicationasavaccineplatform。

研究背景

Reserchbackground

细胞外囊泡（extracellularvesicles,EVs）由活细胞分泌的纳米级膜性小泡，具有磷脂双分子层结构，内部包含蛋白质、RNA等。年，研究人员首次利用电子显微镜从革兰氏阴性菌——大肠杆菌周围观察到EVs。大肠杆菌EVs主要由细菌外膜脱落形成，内部包含细菌相关毒力因子，在细菌的致病机理中发挥重要作用。细菌EVs还可以通过诱导适应性免疫反应来充当免疫调节器。由于革兰氏阳性菌具有较厚的肽聚糖壁（PG），主动分泌的EVs相对较少，对其相关的研究也比较局限。

Mainwork

研究人员首先通过透射电镜和纳米粒子追踪仪（nanoparticletrackinganalysis,NTA）建立金黄色葡萄球菌EVs的分离方法，并利用LC-MS/MS对金黄色葡萄球菌EVs蛋白质进行分析和分类。接下来，通过基因工程技术对金黄色葡萄球菌进行修饰，并对其EVs产率、粒径、形貌等进行表征，从而探究影响金黄色葡萄球菌EVs分泌的因素。最后，研究人员对金黄色葡萄球菌EVs进行降毒处理，并评价其作为多组分疫苗对小鼠的保护作用。

图文解读

Picturetextinterpretation

01

JE2金黄色葡萄球菌EVs的分离制备

a：TEM观察EVs从JE2细胞壁释放；

b：JE2于TSB培养基中扩大培养，取菌上清液，过kD滤膜得到粗提EVs，TEM观察；

c：利用碘克沙醇密度梯度离心对粗提EVs进一步分离纯化，各组分间EVs进行SDS-PAGE银染；

d：组分3-8的TEM图像，组分9-11未观察到EVs。

PSMs对LAC金黄色葡萄

球菌EVs分泌的影响

02

a：从相同数量LAC菌、psmα敲除菌、psmβ敲除菌分离EVs，斑点免疫印迹分析。

b：蛋白定量评估?psmα、?psmβ菌株及LAC的EVs产率。

c：NTA评估EVs的粒子浓度。

d：动态光散射（DLS）分析EVs粒径分布。

e：DLS分析EVs平均粒径大小。

f：转导psmα互补基因pPSMα1-4进入JE2菌株，TEM显示完整细菌产生丰富EVs。

03

PG交叉连接的减少使得金黄色葡萄球菌EVs的产量和粒径增加

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a：亚抑菌浓度青霉素G（PenG）或红霉素（Erm）的处理JE2，收集纯化EVs，斑点免疫印迹分析。

b：蛋白质定量分析PenG、Erm处理JE2后分泌EVs的产率。c：通过斑点免疫印记评估来自JE2、MW2、COL金黄色葡萄球菌菌株或其同源pbp4突变体的EVs产生。

d：蛋白质定量分析pbp4敲除金黄色葡萄球菌EVs产率。

e：从JE2，COL，Newman菌株，以及它们的?tagO或?dltA突变体分离EVs，通过斑点免疫印迹分析EVs的产生。

f：蛋白质定量分析?tagO或?dltA突变体分离EVs的产率。

g：DLS分析tagO、pbp4敲除的JE2菌株以及PenG处理的JE2菌株分泌EVs的粒径分布。

h：DLS分析平均粒径。

i：NTA分析EVs的粒子浓度。

j：PenG处理JE2菌株分泌EVs的TEM图像。

k：pbp4敲除JE2菌株分泌EVs的TEM图像。

自溶素sle1和atl促进金黄色

葡萄球菌分泌EVs

04

a：斑点免疫印迹分析JE2、Newman菌株及其sle1或atl敲除突变体菌株EVs的产生。b：蛋白质定量分析sle1或atl敲除突变体菌株EVs的产率。

c：NTA分析sle1或atl敲除突变体菌株EVs的粒子浓度。

d：DLS分析EVs的粒径分布。

e：DLS分析EVs的平均粒径。

05

金黄色葡萄球菌荚膜多

糖（capsularpolysac-

charide,CP）合成对EVs分泌的影响

a：从Newman,,菌株以及CP敲除菌株分离EVs，斑点免疫印迹分析。

b：蛋白质定量分析CP敲除菌株EVs的产率。

工程化EVs对小鼠的免疫原性和保护作用

06

a：ELISA分析小鼠血清中工程化EVs（eng-EVs）的含量。

b：ELISA分析小鼠血清中Hlα的含量。

c：ELISA分析小鼠血清中LukE的含量。

d：用BSA或不同EVs制剂免疫的小鼠血清，用含有Hlα血清稀释，37℃孵育1h后再加入靶细胞，测定其中和活性。

e：测定小鼠血清对LukED中和能力。

f:测定小鼠血清对HlgAB的中和活性。

g：eng-EVs提高LAC金黄色葡萄球菌败血症小鼠的生存率。

h：eng-EVs提高NRS金黄色葡萄球菌败血症小鼠的生存率。

总结

Conclusion

EVs由哺乳动物细胞、植物细胞、真菌和细菌分泌，且包含脂质、蛋白质、核酸等成分。相关研究已经证明EVs在微生物生理学、发病机理学和细胞间通讯中发挥作用，以调节生物过程和宿主与生俱来的免疫反应。该工作以JE2金黄色葡萄球菌为主要菌株，JE2是美国流行CA-MRSA的S.aureusUSA菌株的代表。研究人员通过超滤和碘克沙醇密度梯度离心相结合的方法得到纯化JE2-EVs，JE2-EVs包含一系列细菌抗原，包括脂蛋白、外毒素和细胞质蛋白等。

该工作还分析了影响金黄色葡萄球菌分泌EVs的影响因素。PSMα是由金黄色葡萄球菌分泌的表面活性剂样多肽，对白细胞、上皮细胞和内皮细胞有裂解作用。与WT-EVs相比，PSMα突变体EVs不太丰富，尺寸更小。作者推测，PSMα由于其表面活性活性，以及两栖螺旋结构，可能会增强细胞质涡轮压下的膜曲率，导致膜中断和EVs的形成。金黄色葡萄球菌细胞壁由高度交叉相连的PG层、蛋白质和糖聚合物（如脂质酸、WTA和CP）组成。高度交叉连接的PG是EVs生物生成的屏障，因此使用PenG亚致命浓度的金黄色葡萄球菌或pbp4或tagO的突变体破坏金黄色葡萄球菌细胞壁的生成，发现EVs产量和尺寸显著增加。MW2，COL和Newman菌株中也出现PG交叉连接和EVs产量之间的这种反相关性。Atl和Sle1在细胞分裂期间表现出PG水解酶活性，敲除Atl或Sle1显著减少EVs的产生，表明Atl和Sle1参与EVs的生成。

由于EVs包含细菌的许多致病性抗原，将金黄色葡萄球菌EVs降毒处理后，发现工程化EVs可以作为多组分疫苗预防致命的肺炎和腹膜炎，减少坏死性皮肤脓肿的发病率。工程化EVs与纯化成分疫苗比具有独特的优势，可以使小鼠产生多种毒素的中和抗体，提高败血症的生存率。

Theend

NatCommun.,9(1):.doi:10./s---z.

生物材料与高端制剂

分享｜李思敏

编辑｜谭申宇

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